Специфичность (обнаружение) вторичных антител

антителаВ большинстве случаев для иммунологических анализов используют поликлональные антитела типа IgG (например, поликлональные антитела к иммуноглобулинам козы, кролика, курицы и т.д.) или моноклональные антитела от мышей, крыс или хомяков. Вторичные антитела должны иметь максимально возможную чувствительность к этому первичному антителу.

Как правило, это вторичное антитело, для получения которого в качестве иммуногена использовалась целая молекула IgG(H+L). При этом распознается большое количество эпитопов на антителах разных классов и подклассов.

Если в запланированном анализе должно быть обнаружено только одно первичное антитело, а иммуноглобулины других классов или подклассов не являются мешающим фактором, как это имеет место в большинстве случаев, обычно наиболее подходящей является специфичность IgG (H+L).

В эксперименте часто приходится обнаруживать одновременно несколько первичных антител разных видов (множественное окрашивание). В этом случае перекрестное обнаружение должно быть предотвращено. Это происходит за счет адсорбции антител против иммуноглобулинов других видов. Тогда оптимальная специфичность для каждого из вторичных антител по-прежнему составляет IgG(H+L).

Иммуноглобулин G (IgG) состоит из двух идентичных легких («L»ight) и двух идентичных тяжелых («H»eavy) полипептидных цепей, которые соединены ковалентными дисульфидными мостиками. Нижняя область называется фрагментом Fc (кристаллизуемый фрагмент). Два плеча, каждое из которых образовано из верхней части Н-цепи и L-цепи, называются Fab-фрагментом (антигенсвязывающим фрагментом). Каждая из легких цепей состоит из вариабельного (VL) и константного домена (CL). С другой стороны, каждая из тяжелых цепей имеет один вариабельный и три константных домена. Они обозначаются аналогично как VH и CH1, CH2, CH3.

Виды животных (например, козы), у которых должна быть получена антисыворотка («хозяин»), иммунизируют очищенным мышиным иммуноглобулином IgG (H+L). Как правило, иммуноглобулины, используемые для иммунизации, получают из цельной сыворотки, т.е. состав отдельных подклассов и частей соответствует нормальному распределению в сыворотке.

Антисыворотка козы, иммунизированной IgG(H+L), содержит антитела, направленные как против легкой, так и против тяжелой цепи молекулы IgG. Эта антисыворотка реагирует как с частями F(ab’)2, так и с частью Fc IgG. Следовательно, анти-IgG также очень хорошо реагирует с другими классами иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgE), поскольку они имеют такие же легкие цепи ( и ). Антитела анти-IgG (H+L), которые не были предварительно адсорбированы, имеют примерно 40-60% реактивности с легкими цепями. В случае сильно адсорбированных анти-IgG (H+L) антител этот показатель может быть значительно ниже.

Иммунизация (например, коз) очищенным Fc-фрагментом IgG (например, от человека) приводит к получению антител, которые обнаруживают тяжелую цепь молекулы IgG высокоспецифичным образом. Поскольку различия между различными классами иммуноглобулинов лежат в области тяжелой цепи, здесь можно очень хорошо обнаружить IgG, но не IgM, IgA и IgE. Эти антитела, специфичные к Fc-фрагментам, часто дополнительно предварительно адсорбируются против F(ab’)2-фрагментов. В некоторых случаях возможная перекрестная реакция против IgM и IgA (античеловеческие) или только против IgM (антимышиные, антикрысиные) сводится к минимуму за счет дополнительной предварительной адсорбции. Эти антитела (античеловеческие, антимышиные, антикрысиные) обозначаются как «Fc». Они имеют менее 1% остаточной активности в отношении легких цепей или IgM или IgA.

Антитела анти-IgG (Fc) не реагируют со всеми подклассами IgG, а также с антителами, специфичными к фрагменту F(ab’)2, анти-IgG. Из-за низкого процента антител против редких подклассов IgG (IgG3 и IgG4) для выявления этих подклассов лучше использовать анти-IgG (H+L) или анти-IgG F(ab’)2 антисыворотки.